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流式细胞术在高档植物研究中的应用

  流式细胞术(Flow cytometry,简称FCM)是20世纪70年月成长起来的一种对细胞的物理性子及化学性子,如细胞巨细、内部布局、DNA、RNA、卵白质、抗原等举办快速测定并可分类网络的技能。该技能逾越了传统显微说明技能,能在刹时对大量细胞举办精确的说明。这种快速有用的细胞说明技能已普及应用于细胞生物学、免疫学、发育生物学、细胞动力学、心理学、分子生物学等生物学研究的各个规模【--,在其基本上成立的流式细胞仪体系,具有体积小、成果全和行使利便等特点。本文扼要先容FCM 的道理,对其在高档植物研究中的应用作了综述。

  1流式细胞术的道理

  流式细胞术是一种可以或许对液流中的细胞或其他微粒举办多参数快速说明和分选的技能。它的工

  作道理是:在必然压力下,细胞随鞘液从样品池通过喷嘴中心进入照明室,通过激光束时使激光产生

  散射和折射,由前向散射光(FSC,Forward scatter)和侧向散射光(ssc,Side scatter)检测器把散射光信

  号转换成电信号,同时细胞所携带的荧光素被引发后所发出的荧光由聚光器网络。差异颜色的荧光被

  双色反光镜转向差异的光电倍增管检测器,经放大后的荧光信号和散射光信号一路通过数据化处理赏罚,

  再输入电脑储存并据此对细胞举办说明和分选t21。

  流式细胞术的首要特点是:

  ① 丈量速率快,可在1 S内测定命万个细胞;

  ② 同时举办多参数丈量,可以对统一个细胞做有关物理特征、化学特征的多参数丈量,并具有明明的统计学意义;

  ③ 是一门综合性的高科技要领,它综合了激光技能、计较机技能、流体力学、细胞化学、图像技能等规模的常识和成就;

  ④ 既是细胞说明技能,又是准确的分选技能。

  总之,流式细胞术首要包罗了样品的液流技能、细胞的分选和计数技能,以及数据的收罗和说明技能等。

  2.细胞的参量和荧光探针

  FCM 是通过丈量细胞的多种参量来获守信息的,细胞参数分为布局参量和成果参量两大类。结

  构参量首要用于描写细胞的化学组分和形态特性,譬喻DNA、RNA的含量,总卵白含量、胞内PH值

  和细胞巨细等;成果参量首要是描写细胞整体的理化和生物特征,如:细胞周期动力学、非凡配体的鉴

  定、非凡细胞的生物活性等,这些参量有的必要经荧光标志才气被测定,有的并不必要荧光标志[4]。

  2.1参数丈量的道理

  流式细胞计举办多参数丈量时,信息首要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。丈量是在丈量

  区举办,所谓丈量区就是照射激光束与喷出喷孔的液流束的垂直相交点。当液流中央的单个细胞通过

  丈量区时,受到激光照射会向立体角为2"tr的整个空间散射光泽, 散射光的波长和入射光的波长沟通。散射光的强度及其空间漫衍与细胞的巨细、形态、质膜和细胞内部布局亲近相干,未蒙受任何破坏的细胞对光泽都具有特性性的散射,因此可操作差异的散射光信号对未经染色的活细胞举办说明和分选。颠末牢靠和染色处理赏罚的细胞因为其光学性子的改变,散射光信号差异于活细胞。散射光不只与作为散射中心的细胞参数相干,还跟散射角及网络散射光泽的立体角等非生物身分有关。

  2.2细胞参数的测定

  2.2.1 DNA和RNA含量

  对DNA和RNA的测定及其含量的说明可以用多种荧光探针标志后测出。常用的荧光探针有吖啶橙(AO,Acridine—orange)、派洛宁Y(PY,I~yronineY)、HO(Hoechst)系列和色霉素A (CA )等。操作HO/CA 双染色还可说明DNA的碱基构成,其它还可以团结BrdU(Bromodeoxyuridine,溴脱氧尿嘧啶核苷)单克隆抗体免疫荧光来测定细胞内DNA的合成。

  2.2.2卵白质总量

  用FCM 可以测定细胞中卵白的总含量,以检测一个细胞群体发展和代谢的状态,或区别具有差异卵白含量的细胞亚群。检测总卵白的常用荧光探针为异硫氰酸荧光素(FITC,Huorescein isothio—cyanate),FITC以共价键与卵白上带正电的残基团结,经蓝光引发后发出豁亮的绿色荧光。

  2.2.3非凡配体

  配体是与差异的细胞布局特异性团结很强的各类大分子和小分子物质,通过对特异性荧光标志配体的测定可以得到不少有关布局参量和成果参量的信息。用于这方面事变的荧光探针首要有FITC、罗丹明系列(如四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC、异硫氰酸罗丹明X-RITC和美国德州红等)、藻胆卵白系列等。

  2.2.4生物活性

  生物活性的测定首要包罗两方面:① 细胞自己的死活;② 活细胞生物成果施展的强弱。FCM用来判定细胞死活的常用荧光探针有两大类:一类是能透度日细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质,譬喻二乙酸荧光素(FDA,Fluorescein diacetate),它可被活细胞滞留而发出黄绿色荧光。若细胞有损伤则会从细胞中流失,调查不到荧光。另一类不能透度日细胞膜,但能对牢靠的细胞及膜损坏的细胞核举办染色,譬喻碘化丙啶(PI,Propidium iodide)和溴化乙锭(EB,Ethidium bromide)。

  3流式细胞术在高档植物中的应用

  3.1应用于植物中的非凡性

  因为植物细胞与动物细胞在布局上的差别,譬喻植物细胞具有细胞壁、非凡细胞器以及中央液泡等,因此流式细胞术应用于植物细胞时,在样品制备、染色、仪器的改革等方面都应顺应植物细胞的上述特点。

  3.1.1制备植物染色体悬液的原料

  1984年De Laat和Blass用纤细单冠菊(Happus gracilis)的悬液细胞第一次对植物染色体悬液举办流式计数说明,然而核型的不不变性却成为流式细胞术应用于计数的最大障碍。随后ConiatS]等实行着从幼叶原生质中疏散出染色体举办说明,但因为细胞同步化水平较低,这种要领没有获得普及的应用。直到1992年Dolezelt9]~lJ用根尖破碎组织制备细胞悬液,因为大大都植物的根尖较易得到且其核型较不变,因此操作根尖原料制备染色体悬液成为普及行使的要领。

  3.1.2细胞周期同步化和中期染色体富集

  为了富集足量同步化的中期染色体,秋水仙碱常被用于克制有丝破碎进程中纺缍丝的形成。但因为其对植物微管卵白亲和力较低,必要行使较高的浓度,对人领会造成高毒性的危害以及在植物遗传上发生不不变性。其它秋水仙碱也会导致染色体过于浓厚,不合用于染色体分拣等后续操纵。1992年Dolezel等发明应用甲基氨草磷(APM’Apiprophos—methy1)、安磺灵(Oryzalin)、氟乐灵(Trifluralin)等人工除草剂取代秋水仙碱,,在微摩级浓度时便可见明显的抗微管浸染。

  3.1.3染色体悬液的制备


更新日期: 2018-08-20 08:00
编辑作者: Sungame
文章链接:http://www.97yc.cn/jicenggongzuo/525.html  [分享本文-流式细胞术在高档植物研究中的应用]
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